簡(jiǎn)化復(fù)雜的熒光多孔板檢測(cè)方法

點(diǎn)擊次數(shù)：930 更新時(shí)間：2023-08-09

細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過程中以消除不需要的細(xì)胞，或者發(fā)生在成年人的愈合過程中，以消除身體的受損細(xì)胞，幫助預(yù)防癌癥。用多孔板進(jìn)行的Caspase檢測(cè)實(shí)驗(yàn)使研究人員能夠研究細(xì)胞凋亡的早期階段。在這篇文章中，我們展示了MICA如何與熒光多孔板測(cè)定一起應(yīng)用，以提供*時(shí)空相關(guān)性的數(shù)據(jù)，并將串?dāng)_降至zui di。

U2OS細(xì)胞在加入細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素后，在13小時(shí)延時(shí)成像過程中拍攝標(biāo)記了SiR Actin、TMRE、CellEvent™和DAPI的圖像。

熒光檢測(cè)的基礎(chǔ)知識(shí)

多孔板對(duì)于需要更高通量的實(shí)驗(yàn)非常有用。它們能讓用戶收集384、96或24個(gè)不同的平行實(shí)驗(yàn)（或樣品）的數(shù)據(jù) [1]。現(xiàn)代檢測(cè)試劑盒通常用熒光探針或染料來標(biāo)記感興趣的蛋白，然后再用熒光顯微鏡對(duì)每個(gè)孔板中熒光標(biāo)記的樣品進(jìn)行分析[2,3]。高通量的熒光多孔板檢測(cè)在神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的很多實(shí)驗(yàn)中都有廣泛的應(yīng)用。幸運(yùn)的是，許多這類熒光檢測(cè)的試劑盒在市場(chǎng)上可以買到，這有助于大大簡(jiǎn)化樣品制備，為用戶節(jié)省大量的時(shí)間和精力。

細(xì)胞凋亡和Caspase蛋白

細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過程中以消除不需要的細(xì)胞，或在成年人的愈合過程中消除身體的受損細(xì)胞，幫助預(yù)防癌癥[4-6]。Caspases家族（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）是一個(gè)大型的半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行中起著重要作用[5,6]。啟動(dòng)型caspases幫助啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，而執(zhí)行型caspases進(jìn)行大量蛋白水解。Caspase-3和caspase-7都是執(zhí)行者型caspases[5,6,7]。caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中有協(xié)調(diào)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的作用，而caspase-7有細(xì)胞脫離的作用[7]。

Caspase測(cè)定法

Caspase檢測(cè)可以研究細(xì)胞凋亡的早期階段。在這里，我們研究了caspase-3和capase-7被細(xì)胞毒性藥物（如星形孢菌素）激活的劑量依賴性。為了消除隨機(jī)效應(yīng)，在相同的條件下用不同濃度的一種藥物或多種藥物的組合，對(duì)多個(gè)檢測(cè)樣本進(jìn)行了研究。具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果通常需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)次。

Caspase檢測(cè)中的挑戰(zhàn)

caspase檢測(cè)透露的主要是caspase激活級(jí)聯(lián)開始時(shí)的信息。然而，關(guān)于單個(gè)細(xì)胞的其他形態(tài)學(xué)或激活反應(yīng)的問題仍未得到解答。Caspase檢測(cè)中加入更多的熒光染色劑可以獲得更多的信息，例如在凋亡過程中的細(xì)胞骨架行為或xi bao se su c介導(dǎo)的凋亡小體的組裝導(dǎo)致caspase-3和caspase-7切割途徑的激活[8]。在caspase檢測(cè)中要快速收集所有熒光標(biāo)簽的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)在規(guī)定時(shí)間間隔獲取整個(gè)樣本板上的數(shù)據(jù)，可能是很困難的。其次，很難快速并可靠地分離多達(dá)四個(gè)熒光標(biāo)簽的信號(hào)。最后，如果數(shù)據(jù)的獲取與caspase活性的檢測(cè)不是同步的，它們就不直接相關(guān)。

由于這些挑戰(zhàn)，在進(jìn)行caspase測(cè)定，特別是在結(jié)合額外的標(biāo)記以獲得更多信息時(shí)，常常會(huì)有一些擔(dān)憂。激活反應(yīng)前后和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)可能會(huì)丟失或沒有時(shí)空即位置和時(shí)間方面的相關(guān)性。另外，熒光標(biāo)簽之間的串?dāng)_也會(huì)導(dǎo)致對(duì)結(jié)果的誤解。

目前，大量的研究實(shí)驗(yàn)室可能沒有現(xiàn)成的用于這些檢測(cè)工作的所有儀器和顯微鏡。這個(gè)問題通常通過使用多個(gè)研究小組和用戶的共享設(shè)備來解決，但這意味著可能需要很長時(shí)間才能獲得所需的儀器。

這些挑戰(zhàn)可能導(dǎo)致延遲獲得重要的、可量化的結(jié)果，而這些結(jié)果會(huì)影響根本性突破和獲得新的見解。

Mica介紹

Mica是全場(chǎng)景顯微成像分析平臺(tái)，它將研究人員需要的一切都統(tǒng)一在一個(gè)wan quan可控的、高度靈活的環(huán)境中，加速顯微鏡的工作流程，以便更快地獲得有意義的科學(xué)結(jié)果。通過使用這個(gè)顯微成像分析平臺(tái)，您可以從以下方面受益：

人人皆享：即使是沒有經(jīng)驗(yàn)的用戶也能用MICA輕松設(shè)置復(fù)雜的檢測(cè)讀數(shù)。

觸手可及：MICA使得用戶能同時(shí)對(duì)4個(gè)標(biāo)記進(jìn)行成像，具有*的時(shí)空相關(guān)性。

ji zhi簡(jiǎn)化工作流程：MICA對(duì)4個(gè)標(biāo)記的同時(shí)采集以及后續(xù)AI驅(qū)動(dòng)的數(shù)據(jù)分析都顯著減少了工作流程步驟。

方法

MICA用于熒光多孔板檢測(cè)來研究caspase-3和caspase-7在激活凋亡中的作用（圖1）。制備U2OS細(xì)胞相關(guān)樣品，最后用星形孢菌素處理以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)有多個(gè)與凋亡早期階段相關(guān)的讀數(shù)。

結(jié)果

圖1結(jié)果顯示了星形孢菌素誘導(dǎo)的caspase-3和caspase-7的激活，在此之前是應(yīng)力纖維的形成和線粒體膜電位的耗盡。

圖1：圖中顯示了實(shí)驗(yàn)工作流程和caspase檢測(cè)的結(jié)果。

用MICA實(shí)現(xiàn)了4種熒光標(biāo)記物的絕對(duì)時(shí)空相關(guān)性，由此可以對(duì)凋亡誘導(dǎo)的早期進(jìn)行監(jiān)測(cè)（參考視頻1和圖2）。觀察到應(yīng)力纖維的形成與caspase-3和caspase-7激活開始時(shí)線粒體膜電位的喪失相吻合。DNA凝結(jié)直接跟隨caspase激活。

視頻 1：U2OS細(xì)胞在63倍寬場(chǎng)模式下采集13小時(shí)的延時(shí)拍攝視頻。A) 細(xì)胞用SiR-Actin、TMRE（63倍放大，線粒體活性）、CellEvent™（caspase活性）和DAPI（細(xì)胞核）標(biāo)記。在t0加入凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素。

圖2：同一數(shù)據(jù)集，每列顯示單個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每行顯示單個(gè)標(biāo)記。

圖3為傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡和MICA的時(shí)空多色采集對(duì)比。熒光標(biāo)記的同步檢測(cè)在研究線粒體動(dòng)力學(xué)時(shí)，消除了觀察線粒體結(jié)構(gòu)和膜電位時(shí)的時(shí)空偽影。使用傳統(tǒng)寬場(chǎng)成像時(shí)，由序列采集產(chǎn)生的時(shí)空偽影會(huì)使測(cè)量結(jié)果失真，并影響結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)性。MICA的FluoSync技術(shù)能同時(shí)采集并確保時(shí)空相關(guān)性，采集時(shí)沒有偽影，膜電位與線粒體結(jié)構(gòu)正確相關(guān)。

圖3：MICA的63x/1.2 W PL Apo CS2 SmartCORR物鏡在寬場(chǎng)模式下拍攝的用MitoTracker™綠色（青色）和四甲基羅丹明乙酯（TMRE，品紅）染色的U2OS細(xì)胞圖像。A) 序列采集MitoTracker™綠色通道和TMRE通道，其中裁剪圖像顯示由于序列采集兩個(gè)通道之間出現(xiàn)了時(shí)空偏移。B）同時(shí)采集MitoTracker™綠色通道和TMRE通道，裁剪的圖像顯示兩個(gè)通道之間沒有任何時(shí)空偏移。兩個(gè)通道保持共定位，并能夠?qū)γ總€(gè)MitoTracker™綠色結(jié)構(gòu)（線粒體結(jié)構(gòu)）中的TMRE信號(hào)（線粒體膜電位）進(jìn)行量化測(cè)量。比例尺為5µm。

與傳統(tǒng)的寬場(chǎng)顯微鏡不同的是Mica FluoSync[10]可以同時(shí)進(jìn)行4色標(biāo)簽成像、寬光譜譜檢測(cè)和拆分[9] （參加圖4）。

圖4：A) 傳統(tǒng)寬場(chǎng)4色熒光成像使用帶通熒光發(fā)射濾波器：結(jié)果是染料分離度差，導(dǎo)致定位精度低，切斷信號(hào)式減少串?dāng)_，序列成像慢。B) 帶FluoSync技術(shù)的MICA可以同時(shí)進(jìn)行4個(gè)標(biāo)簽的成像，寬光譜檢測(cè)和拆分[9]進(jìn)行真正的染料分離，以及4倍的同時(shí)成像速度。

參考資料

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W. Ockenga, An Introduction to Fluorescence, Science Lab (2011) Leica Microsystems.
W. Ockenga, Fluorescence in Microscopy, Science Lab (2011) Leica Microsystems.
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FluoSync - a Fast & Gentle Method for Unmixing Multicolour Images: A streamlined approach for simultaneous multiplex fluorescent imaging using a single exposure, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

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